In dieser Arbeit wurde untersucht, wie man Nukleinsäuren zirkularisieren kann und welche Voraussetzungen gegeben sein müssen, um die Zuverlässigkeit bei der Herstellung zirkulärer RNA zu erhöhen.
Zirkuläre RNA ist sehr vielfältig in der Natur vorhanden, sowohl in Eukaryoten als auch in Bakterien und Archaeen. Dennoch ist sie bisher noch groß teils unerforscht. Die konventionelle Methode, Mithilfe von Enzymen die Enden von RNA zu zirkulären RNA zu verbinden, ist zudem sehr fehleranfällig.
Entsprechend war in dieser Arbeit nur eine von vier unterschiedlichen Ligationen erfolgreich, was die Fehleranfälligkeit einer Zirkularisierung mit den gängigen Ligasen unterstreicht. Als wesentliche Erkenntnisse dieser Arbeit benötigt zum einen die Zirkularisierung mit T4 RNA Ligase freie Enden der RNA. Zum anderen sind für eine Ligation mit T4 DNA Ligase auch höhere Temperaturen in Betracht zu ziehen, als bisher verwendet. Wichtig dabei ist, dass am Ende der verwendeten DNA eine Phosphatgruppe vorhanden ist.
In dieser Arbeit wurde eine RNA gestaltet, die in einer Polymerasekettenreaktion repliziert und anschließend in RNA transkribiert wurde. Mit dieser RNA wurden zwei unterschiedliche Ligationen durchgeführt. Zum einen wurden die beiden Enden der einzelnen RNA Stränge mit T4 RNA Ligase 1 ligiert, zum anderen mithilfe einer Bridge mit T4 DNA Ligase. Zwei weitere Ligationen mit T4 DNA Ligase wurden ebenfalls unter Zuhilfenahme einer DNA Bridge mit einer DNA durchgeführt, wobei eine DNA eine Phosphatgruppe am 5‘ Ende hatte. Um festzustellen, ob die erzeugten Nukleinsäuren zirkulär sind, wurden Proben dieser Nukleinsäuren sowohl mit Endonukleasen als auch mit Exonukleasen degradiert. Anschließend wurden die Proben durch Polyacrylamidgelelektrophoresen in ihre Bestandteile zerlegt, nach Größe sortiert und durch Einfärben sichtbar gemacht.
Es stellte sich heraus, dass ein Zusammenschluss der beiden Enden eines Nukleotidstranges der RNA nicht möglich war, wenn ein Ende bei Ligation mit T4 RNA Ligase 1 an die RNA selbst bindet. Außerdem bestätigte sich, dass das 5‘ Ende der Nukleinsäurekette eine Phosphatgruppe besitzen muss, damit die T4 DNA Ligase in der Lage ist die Nukleinsäuren zu zirkularisieren.
Bei Raumtemperatur war eine Zirkularisierung mit einer DNA mit Phosphatgruppe am 5‘ Ende mit T4 DNA Ligase nicht möglich, obwohl vom Hersteller empfohlen. Jedoch konnte sie bei einer höheren Temperatur von 37°C erfolgreich durchgeführt werden.
Circularization of nucleic acids
In this work it was investigated how to circularize nucleic acids. In addition requirements were explored that are essential for a ligation in order to increase the reliability when producing circular RNA.
Circular RNA exists in various forms in nature in eukaryotes as well as in bacteria, archaea and viruses. Nevertheless, little research was done on this topic. The conventional method to link the ends of RNA with the help of enzymes to produce circular RNA is error-prone.
Accordingly, only one out of four different ligations was successful in this work. This confirms that the circularization with the common ligases has only limited prospect of success.
As main outcome of this work, circularizing RNA with T4 RNA Ligase needs free ends of the RNA. Furthermore, higher temperatures should be considered when using T4 DNA Ligase. It is thereby essential that a phosphate group exists at the end of the employed DNA.
In this work a special designed DNA was replicated in a polymerase chain reaction and was transcribed into RNA. With this RNA two different ligation processes were carried out. In the first process, both ends of the single stranded RNA were ligated with T4 RNA Ligase 1. In the second process a bridge and T4 DNA Ligase was employed. Two further ligations of DNA, one with a phosphate group at the 5’ end, were carried out also with the aid of bridges and with T4 DNA Ligase.
In order to determine whether the received nucleic acids became circular, samples of these nucleic acids were degraded by both endonucleases and exonucleases. Afterwards the several components of these samples were sorted by length and visualized by dyeing in polyacrylamide gel electrophoreses.
It was discovered that a link between both ends of a single stranded RNA was not possible if one of the ends was binding to the RNA itself when using T4 RNA Ligase 1 for the ligation. Furthermore it was shown that a phosphate group is needed at the 5’ end for a successful circularization of nucleic acids with the enzyme T4 DNA Ligase.
Circularization at room temperature, although recommended by the manufacturer, was not possible. However, when using DNA with a phosphate group at the 5’ end the ligation with T4 DNA Ligase was successful at a higher temperature of 37°C.