Das Ziel der Forschungsarbeit war es, die Detektion des GABA-Rezeptors mithilfe der Western Blot Methode zu ermöglichen. Dazu wurden verschiedene Versuchsreihen mit Gewebeproben aus verschiedenen Teilen des Gehirns einer Maus (Thalamus, Cortex, Hippocampus, Restgehirn) durchgeführt. Zu Beginn wurde versucht die Detektion des GABA-Rezeptors mittels verschiedener Antikörper (Anti-GABAA-α1 Antikörper, Anti-GABAB-R1 Antikörper und Anti-GABAA-γ2 Antikörper) zu erreichen. Obwohl man bei allen der untersuchten Antikörper den GABA-Rezeptor detektieren konnte, eignete sich nur der Anti-GABAA-α1 Antikörper, da dieser im Gegensatz zu den anderen keinen Verlauf der Banden sowie weniger Background aufzeigte.
Nun wurden die Antikörper vier verschiedener Firmen verwendet (Abcam, Millipore, Cell Signaling, Santa Cruz), um zu untersuchen von welcher Firma der Antikörper das beste Ergebnis liefert. Auf den Membranen des Antikörpers von Santa Cruz, sowie von Cell Signaling konnte man aufgrund des zu hohen Backgrounds keine Banden erkennen, ohne die keine Analyse angestellt werden kann. Die Antikörper von Abcam und Millipore lieferten jeweils ein gutes Ergebnis, bei dem die Banden auf der Membran gut zu erkennen waren. Allerdings wiesen die Banden der Membran, welche zuvor mit dem Antikörper von Abcam behandelt wurde, zu viel Verlauf auf, weswegen der Antikörper von Millipore als geeigneter eingestuft wurde.
Basierend auf diesen Erkenntnissen, wurde die Rolle der Proteinproben auf die Detektion des GABA-Rezeptors untersucht. Als erstes wurde der Unterschied zwischen gefrorenen und frischen Proteinproben ermittelt. Dabei wurde herausgefunden, dass sowohl gefrorene als auch frische Proben für die Detektion des GABA-Rezeptors geeignet sind. Anschließend hat man analysiert, ob es einen Unterschied zwischen verschiedenen Gewebeproben aus dem Gehirn einer Maus gibt. Es wurde festgestellt, dass im Hippocampus sehr wenig GABA-Rezeptoren enthalten sind, und dieser somit nicht so gut geeignet ist um den Rezeptor zu detektieren. Hingegen lieferten die Proben aus Teilen des Thalamus, des Cortex sowie des Restgehirns gute Ergebnisse, was darauf schließen lässt, dass diese genug GABA-Rezeptoren enthalten, um eine Analyse mithilfe der Western Blot Methode anzustellen.
Detection of the GABA-receptor with the aid of the Western Blot method
The goal of the research was to enable the detection of the GABA receptor using the Western Blot method. For this purpose, different series of experiments with tissue samples from different parts of a mouse brain (thalamus, cortex, hippocampus, residual brain) were performed. At the beginning it was attempted to detect the GABA receptor by means of various antibodies (anti-GABAA-α1 antibody, anti-GABAB-R1 antibody and anti-GABAA-γ2 antibody). Although it was possible to detect the GABA receptor in all of the antibodies that were tested, only the anti-GABAA-α1 antibody was suitable, since unlike the others, it showed no progression of the bands and less background.
In order to find out which antibody is most suitable for the detection, four anti-GABAA-α1 antibodies from different firms (Santa Cruz, Cell Signaling, Abcam. Millipore) were selected. It was not possible to detect the proteins bands using antibodies of Santa Cruz and Cell Signaling due to the high background. Although their antibodies could not be used, because the appearance of the bands on the membrane is essential for the success of the experiment. The antibodies from Abcam and Millipore both gave a good result, as the bands on the membrane were clearly visible. However, the bands of the membrane treated with the antibody from Abcam had their visibility impairing on the edges and therefore Millipore’s antibody was considered more suitable than the Abcam antibody.
Based on these results, the role of protein samples in the detection of the GABA receptor was investigated. First, the difference between frozen and fresh protein samples was determined. It was found that both frozen and fresh samples are suitable for the detection of the GABA receptor. Subsequently, it was analysed whether there is a difference between varying tissue samples from the brain of a mouse. It has been found that very few GABA receptors are present in the hippocampus, and thus it is not well suited to detect the receptor. By contrast, samples from parts of the thalamus, cortex, and residual brain gave good results, suggesting that they contain enough GABA receptors to do an analysis using the Western blot method.