In meinem Praktikum war ich erst drei Wochen an der Universität Konstanz, wo ich am Doerenkamp-Zbinden Chair for in vitro Toxicology and Biomedicine bei Prof. Marcel Leist am Vertiefungskurs „animal-free methods in pharmacology and toxicology“ teilnahm und Teile zweier Projekte (Isolation von Gamma–Synuclein und Einbringung von PTPS- und TH-Kassetten in LUHMES-Zellen) näher begleitete. Danach war ich eine Woche am Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr an der Sanitätsakademie der Bundeswehr in München, wo ich in der Bioinformatik phylogenetische Bäume erstellte mittels Sequenzen von Affenpocken, die auf den Menschen übergegangen sind.
1. Konstanz
1.1. Vertiefungskurs
Der Vertiefungskurs beinhaltete einen Journal Club, in dem die praktischen Studenten des Kurses Papers präsentierten und diese kritisch diskutiert wurden. Im Fokus standen dabei Papers über neurodegenerative Erkrankungen und Methoden der in vitro-Toxikologie. Darüber hinaus fanden im Rahmen des Journal Clubs zwei Poster Sessions statt, veranstaltet von den praktischen bzw. theoretischen Studenten. Die theoretischen Studenten erstellten dabei Poster über ausgesuchte Papers, während die praktischen Studenten ihre Laborprojekte als Poster präsentierten. Ich erstellte mit einer theoretischen Studentin ein Poster über die Verwendung von Glyoxal als Fixierung für (Super-Resolution)-Mikroskopie und Immunostaining (s. Anhang). Außerdem besuchte ich während meines Praktikums die Vorlesung „Disease Biology II“, das wöchentliche Fachbereichsseminar der Biologie und einen Workshop zu „SEAHORSE“, einem Instrument zur metabolischen Analyse von Zellen.
1.2. Labor
Im Labor betreute mich Christiaan Karreman. Ihn begleitete ich bei der Purifikation von Gamma–Synuclein zum Studium der Aggregation in Parkinson und der Integration von Kassetten in LUHMES-Zellen (eine Zelllinie entwickelt aus humanen embryonalen mesencephalen Zellen), um respektive eine Selektion nach dopaminergischen Neuronen zu ermöglichen und die Dopaminproduktion zu unterstützen. Die Kassetten wurden dabei zusammengebaut aus verschiedenen Plasmiden aus den Lagern des Labors und Plasmiden, die durch die Integration unter Verwendung von Topoisomerase von PCR-Fragmenten in vorgefertigte Plasmide von invitrogen hergestellt wurden. Dabei war es nicht mehr im zeitlichen Rahmen, die Kassetten komplett zusammenzubauen, jedoch konnte ich den Zusammenbau der Ausgangsmaterialien und die Planung des Workflows miterleben. Darüber hinaus schaute ich gelegentlich bei den Projekten der praktischen Studenten vorbei und bekam dort u.a. auch Zellkultur und das direkte Arbeiten mit dem SEAHORSE mit.
Im Labor wurde eine Reihe von klassischen biologischen und gentechnischen Arbeitsmethoden bzw. Werkzeugen verwendet, so z.B. Restriktionsenzyme, rekombinante DNA, Transformation in E. coli, PCR, Gelelektrophorese, Western Blotting und die Auswertung von Sanger-Sequenzdaten. Im Rahmen der Proteinaufreinigung wurden darüber hinaus Dotblots, FPLC, Coomassi-Gele und MS verwendet.
2. München
Am InstMikBioBw implementierte ich unter der Betreuung von Dr. Markus Antwerpen und Mathias Walter eine Software in R, die mithilfe von verschiedenen Methoden (UPGMA, NJ, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood) phylogenetische Bäume („Familienstammbäume“) aus Sequenzen von Affenpocken, die auf den Menschen übergegangen sind, ermittelt und die Verlässlichkeit einzelner Kanten mithilfe von Bootstrap quantifiziert. Dabei benutzte ich die packages phangorn und ape.
Am InstMikBioBw konnte ich auch einen Blick auf die Sequenzierer werfen, die solche Arbeiten überhaupt erst möglich machen. Mittlerweile werden am InstMikBio nur noch Next-Generation Sequencing(NGS)-Sequenzierer benutzt, allerdings konnte ich noch einen alten Sanger-Sequenzierer sehen. Verwendet werden dabei IonTorrent-, Illumina(MiSeq)- und Nanopore(MinION)-Sequenzierer. Letztere werden derzeit ausschließlich von der Firma Oxford Nanopore vertrieben, mit der das InstMikBioBw eine relativ enge Beziehung hat, sodass die neusten Geräte häufig zum Beta-Testen an das Institut gegeben werden. Dabei wurde mir in meinem Praktikum insb. über Nanopore einiges erzählt, da für den Bioinformatiker auch eine Kenntnis der Herkunft der Sequenzen, mit denen er arbeitet, wichtig ist. Nanopore ist hierbei eine aufstrebende Technologie, von der erwartet wird, dass sie andere Sequenziermethoden größtenteils verdrängen wird.
Der Vorteil von Nanopore-Sequenzierern gegenüber anderen erhältlichen Sequenzierern ist derzeit primär ihre Größe und Portabilität (siehe Abbildung 2; andere Geräte reichen von größer als ein Kühlschrank zu immer noch deutlich größer als eine Mikrowelle). Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit, RNA zu sequenzieren, ohne sie zuvor mittels reverser Transkriptase in DNA umzuwandeln und so mit weniger Aufwand, höherer Sensitivität und weniger potentiellen Fehlerquellen zu sequenzieren. Darüber hinaus haben Nanopore-Sequenzierer eine sehr hohe read-Länge (die Länge der gelesenen DNA-Fragmente), was sowohl Wiederholungen in der DNA weniger problematisch macht als auch das Assemblieren (Zusammenbauen der sequenzierten Fragmente zur vollständigen Sequenz) deutlich einfacher gestaltet. Bisher ist Nanopore jedoch noch mit einer im Vergleich zu anderen Sequenziermethoden hohen Fehlerquote verbunden, was den großflächigen Einsatz bisher verhindert. Jedoch ist in diesem Bereich massiv Forschung im Gange (s.u.) und es wird erwartet, dass Nanopore in Zukunft die Sequenziermethode sein wird.
Nanopore-Sequenzierung funktioniert, indem die zu sequenzierende DNA (auch RNA; in der Zukunft ist auch Proteinsequenzierung geplant) durch eine sog. „Nanopore“, also ein kleines Loch, in einer sonst undurchlässigen Membran transportiert wird. An dieser Membran liegt eine Spannung an, was zu einem Ionenfluss durch die Pore führt. Dieser Fluss wird auf charakteristische Weise verändert, wenn ein Molekül durch sie gefädelt wird. Das wird gemessen und erlaubt Rückschlüsse darüber, welches Molekül (welche Base) die Pore passiert.
Für dieses sog. „Base Calling“ werden gegenwärtig Machine-Learning Algorithmen verwendet, die relativ rechenintensiv sind. Allerdings ist beim Sequenzieren stets eine Recheninfrastruktur gegeben, da danach sowieso noch assembliert werden muss. Wegen der größeren Read-Länge von Nanopore ist die Assemblierung, die einige Rechenleistung braucht, tatsächlich deutlich leichter. Zukünftige Geräte werden das Base Calling auf internen Computern durchführen, die eine dazu optimierte Architektur haben.
Oxford Nanopore verwendet als Nanopore modifiziertes Alpha-Hämolysin ($latex {\alpha}&fg=000000$-HL), allerdings sind auch andere Porine und anorganische(„solid-state“) Poren ein aktueller Gegenstand der Forschung. Des Weiteren wird derzeit daran geforscht, die Molekülpassage anders als durch Veränderungen im Ionenfluss zu detektieren: Gegenwärtige Ansätze sind z.B. die lokale Spannung, die vom passierenden Molekül induziert wird, Elektron-Tunnel-basierte Detektionsverfahren, kapazitative Detektoren und Graphen-basierte Edge-State-Methoden.
Graphischer Output des phylogenetischen Baums
Nanopore-Sequenzierer Links: Oxford Nanopore MinION mit Test-Flowcell. Rechts: MinION mit Finger zum Größenvergleich